INMUNOHISTOQUIMICA E INMUNOCITOQUÍMICA: APLICACIONES POTENCIALES – Dra. Adriana Massone, Dra. Mariana Machuca

INMUNOHISTOQUIMICA E INMUNOCITOQUÍMICA: APLICACIONES POTENCIALES
Dra. Adriana Massone, Dra. Mariana Machuca
Laboratorio de Patología Especial Veterinaria, Facultad de Ciencias Veterinarias,60 y 118,
La Plata (1900).
amassone@fcv.unlp.edu.ar; mmachuca@fcv.unlp.edu.ar

XV CONGRESO NACIONAL DE AVEACA
Bs. As. 24 y 25 de Setiembre de 2015
Asociación de Veterinarios Especializados en Animales de Compañía de Argentina
P: 16

 

Inmunohistoquimica

La inmunohistoquímica (IHQ), al combinar técnicas anatómicas, inmunológicas y bioquímicas, permite localizar componentes tisulares definidos “in situ” mediante el empleo de anticuerpos específicos y de moléculas marcadoras.
El fundamento de la inmunohistoquímica (IHQ) consiste en la localización de componentes tisulares mediante la utilización de anticuerpos específicos y moléculas marcadoras (reacción enzimasustrato que transforma un cromógeno incoloro en un producto final coloreado).

Los sueros comerciales, como los producidos en el laboratorio, contienen anticuerpos (Ac). Las presentaciones de los sueros pueden ser muy diferentes (policlonales, monoclonales, conjugados, porción F(ab)2, etc.), pero todos responden al mismo principio: fueron generados en respuesta a un estímulo antigénico.
Se puede definir un antígeno (Ag) como toda sustancia o partícula animada o inanimada, de cualquier constitución química, que introducida a un organismo superior por cualquier vía o bien perteneciente al mismo, no sea reconocida como propia e induzca en éste una respuesta humoral y/o celular detectables tanto “in vivo” como “in vitro”. Existen algunas condiciones para que un Ag tenga capacidad antigénica, siendo las partículas de origen proteico mucho más antigénicas.
Para producir una respuesta inmune de base humoral (formación de Ac), es necesario que el Ag sea procesado en primera instancia por los macrófagos. Estos son los encargados de contactar con los linfocitos T colaboradores (T helper –Th) específicos para cada uno de los epitopes o determinantes antigénicos en que fue fragmentado el Ag. Una vez que se produjo la expansión clonal de los linfocitos Th, estas contactan con los linfocitos B, que se expanden y se forman células plasmáticas productoras de Ac específicos. Tenemos así un conjunto de Ac específicos de distinto tipo que, en conjunto y concentrados en plasma sanguíneo, constituyen un suero policlonal. En este estado un suero inmune está “contaminado” con elementos normales (albúmina, alfa y beta globulinas, electrolitos, etc.), para lo
cual se recurre a técnicas de precipitación, separando así las facciones deseadas. Un suero monoclonal es aquel que concentra, en gran cantidad, Ac específicos contra un solo epitope. Este tipo  de suero solo se logra en el laboratorio mediante procesos biológicos dirigidos. Los Ac, tanto monoclonales como policlonales son utilizados en diferentes técnicas de laboratorio, ya sea conjugados con diferentes elementos tales como sustancias fluorescentes (fluoresceína, rodamina), enzimas (fosfatasa alcalina, peroxidasa), formando parte de inmunocomplejos (PAP) o utilizados sin conjugar. Todas las técnicas de IHQ se basan en la conjugación de distintos marcadores con
moléculas de inmunoglobulinas. Luego de producida la unión Ag-Ac, el marcador es localizado, generalmente por una reacción tintorial, permitiendo identificar la reacción del Ag problema con en la célula o tejido. Las técnicas más utilizadas en la actualidad son las que emplean a la peroxidasa del rábano picante y la fosfatasa alcalina.

Inmunocitoquímica

La inmunocitoquímica (ICQ), inmunocitología o inmunomarcación de preparados citológicos es un método que complementa al estudio citológico convencional, contribuyendo a mejorar la precisión diagnóstica y aportando, en casos particulares, datos de valor pronóstico.
El fundamento de esta técnica es similar al de la inmunohistoquímica (IHQ), pero en el caso de la ICQ, la marcación se lleva a cabo sobre preparados citológicos en lugar de cortes de tejidos. Dichos preparados pueden ser realizados por los métodos tradicionales de toma de muestras para citología o bien mediante preparaciones especiales. Tal es el caso de los bloques celulares, los que se obtienen tras la centrifugación de células en medios líquidos, fijación del sedimento e imbibición en parafina para la realización de cortes finos.
La fijación de los preparados citológicos resulta indispensable para lograr conservar una adecuada cantidad de células, obtener suficiente adhesión al portaobjetos, mantener la morfología celular así como la antigenicidad y remover los fluidos proteináceos y eritrocitos que generan coloración de fondo.
Si bien pueden utilizarse preparados ya teñidos, es probable que se obtengan mejores resultados utilizando preparados fijados especialmente para ICQ.
La precisión de los resultados obtenidos a partir esta técnica depende, en gran medida, de la sensibilidad y la especificidad de los anticuerpos de los que se dispone. Siempre es conveniente incorporar controles positivos y negativos.
El nivel desigual de aceptación alcanzado por las técnicas de IHQ e ICQ se debe, fundamentalmente, a ciertos inconvenientes técnicos y de interpretación que limitan el alcance de esta última.
Los resultados de la inmunomarcación se consideran de valor diagnóstico cuando permiten confirmar una presunción, de valor de rechazo cuando permiten descartarla o equívocos en los casos en que carecen de utilidad.
Resulta difícil unificar los datos encontrados en la bibliografía acerca del aporte concreto de la ICQ, ya que se han comunicado experiencias con células prevenientes de los tejidos más diversos y utilizando paneles heterogéneos de anticuerpos. A pesar de ello, la mayoría de los autores coincide en afirmar que la inmunocitología es una herramienta que supera en sensibilidad y especificidad a la citología convencional. En general, se sostiene que la ICQ tiene valor diagnóstico en un 55% a 65% de los casos.
En un análisis retrospectivo de muestras de fluidos y de material obtenido a partir de lesiones sólidas mediante AAF, Shield y col. encontraron que la inmunomarcación fue de utilidad en el 75,8 % de los casos.

Aplicaciones de la inmunocitoquímica

– Diferenciación entre procesos reactivos y procesos neoplásicos malignos. Metzgeroth et al. (2007) llevaron a cabo un estudio en el que analizaron 1234 muestras provenientes de efusiones serosas, con la finalidad de comprobar si la inmunocitología mejoraba la precisión diagnóstica de la citología convencional en la identificación de efusiones debidas a carcinomas. De las 619 efusiones causadas por procesos malignos, 314 fueron correctamente identificadas mediante citología mientras que, con la inmunocitología realizada utilizando un panel de 3 anticuerpos, el número de diagnósticos correctos ascendió a 561. De los 615 efusiones debidas a procesos no malignos, 50 casos fueron
erróneamente clasificados como causados por carcinomas (falsos positivos) mediante citología. En la ICQ no se observaron falsos positivos.
– Determinación del tejido de origen de una neoplasia. Este podría ser el caso de neoplasias indiferenciadas, primarias o metastásicas. Por ejemplo, las neoplasias melanocíticas pueden ser confundidas con otras neoplasias pobremente diferenciadas, tales como carcinomas, linfomas y sarcomas. Según los estudios realizados por Sheffield et al (2002), la inmunocitología utilizando un panel de al menos 3 anticuerpos, resulta de gran ayuda para el diagnóstico en estos casos. Algo similar ocurre con las lesiones de pulmón en el hombre. Dada la frecuencia de neoplasias primarias y metastásicas en este órgano, en las que la cirugía no es el tratamiento primario, la AAF
suele ser el procedimiento diagnóstico de elección. El uso de marcadores mediante ICQ puede mejorar la eficacia de su identificación (Liu et al, 2004).
– Estadificación de una neoplasia. La ICQ puede realizarse para la investigación del estado del linfonódulo regional. Según lo expresado por Diel et al (2000) en un trabajo realizado en pacientes con carcinomas mamarios, la inmunomarcación de células tumorales en aspirados de médula ósea podría ser considerado como un buen marcador de diseminación de la enfermedad y, por lo tanto, reemplazar, o bien complementar, a la biopsia del linfonódulo regional.
– Evaluar el pronóstico de una lesión tumoral conocida. Un ejemplo es la marcación de indicadores de proliferación tumoral, receptores hormonales y oncogenes (con mayor frecuencia en tumores mamarios). En medicina humana se ha vuelto más frecuente el análisis de receptores hormonales en extendidos de material aspirado con aguja fina debido, entre otras razones, a que permite estudiar lesiones mamarias pequeñas detectables mediante mamografía.
Reemplazo de procedimientos diagnósticos invasivos. Schmitz-Dräger et al (2008) llevaron a cabo un estudio a partir de 222 pacientes con microhematuria a los fines de evaluar la utilidad de la inmunocitología en el diagnóstico de carcinomas de vejiga. El diagnóstico se realizó a través de los procedimientos tradicionales (cistoscopía, análisis de laboratorio e imágenes) y de inmunocitología. Debido a la alta sensibilidad y adecuada especificidad observada con esta última, los autores concluyeron que, basando el diagnóstico en la misma, podría evitarse el uso de los
procedimientos diagnósticos tradicionales, costosos e invasivos, en un gran número de pacientes.
La difusión de la técnica de ICQ es limitada. En medicina humana se utiliza de rutina en algunos centros asistenciales y se ha incorporado en estudios clínicos controlados. En medicina veterinaria, su utilización es experimental. El costo de los anticuerpos para conformar un panel que asegure utilidad de la técnica condiciona grandemente la implementación de la misma, a excepción de aquellos laboratorios en los que la IHQ se realiza de rutina. El conocimiento de los alcances de la ICQ por parte de los profesionales podría incrementar su demanda y así favorecer la puesta en marcha del método en el laboratorio de patología (al menos para casos especiales) y el entrenamiento del personal en la interpretación de los resultados.
Aplicaciones de la inmunohistoquímica en oncología veterinaria. Factores pronósticos En las últimas décadas, la medicina veterinaria ha logrado reducir la mortalidad asociada a las enfermedades infecciosas de los animales de compañía. Es por ello que el promedio de vida de los mismos se ha prolongado considerablemente. En consecuencia, las enfermedades llamadas de la “edad avanzada”, dentro de las cuales se incluyen las neoplásicas, han adquirido una particular importancia. Actualmente se considera que entre el 15 y el 20% de los animales adultos que reciben
atención médica padece procesos neoplásicos. Así, la oncología veterinaria ha surgido como una disciplina compleja y de interés creciente, cuyo propósito es resolver los distintos problemas que plantean los pacientes que padecen una enfermedad tumoral.
El diagnóstico asertivo de la neoplasia, su grado de malignidad y el reconocimiento de su diseminación regional o sistémica constituyen elementos fundamentales para la predicción del comportamiento biológico y para la planificación del tratamiento.
Existe un acuerdo general acerca de que las neoplasias se originan de la expansión clonal de una sola célula que sufrió transformación maligna. La progresión tumoral es el proceso por el cual las células transformadas adquieren más características deletéreas para el huésped. Algunos de los clones que emergen son localmente más agresivos, mientras que otros presentan más probabilidad de generar metástasis, o bien son menos susceptibles a la terapia.
Además de la cinética celular, otros factores modifican la tasa de crecimiento y progresión tumoral. Se ha prestado considerable atención a los mecanismos por los que los tumores adquieren su abastecimiento sanguíneo, ya que del sostén trófico depende su crecimiento y los procesos implicados pueden ser blancos de procedimientos terapéuticos.
Con el objetivo de identificar posibles indicadores pronósticos, sobre todo en medicina humana, una gran variedad de proteínas se encuentra en estudio. Se denominan marcadores tumorales a las sustancias detectables en tejidos tumorales o fluidos corporales de pacientes con neoplasias. Según el origen, pueden ser sintetizadas por las propias células tumorales o por otras, inducidas por ellas. Estas moléculas se clasifican en: moléculas nuevas, moléculas conocidas pero expresadas en forma ectópica, en cantidades anómalas o en momentos del desarrollo diferentes del
habitual y moléculas conocidas pero estructuralmente alteradas. Idealmente, estos marcadores deberían reunir las siguientes características: ser producidos mientras el tumor está presente, ser específicos del tumor o el órgano, ser detectables en todos los pacientes con el mismo tipo de tumor y tener una concentración paralela al crecimiento de la masa tumoral o alguna característica asociada a la progresión. Estos marcadores se analizan en diferentes muestras: tejido tumoral, fluidos o células aisladas. El hallazgo de determinadas proteínas o metabolitos puede caracterizar un tipo tumoral o ser informativo con respecto a la progresión del tumor, entre otras posibilidades. Los objetivos del uso de marcadores tumorales son:
-predecir la susceptibilidad de un individuo a un tumor en particular
-establecer o confirmar un diagnóstico
-asignar un grado de acuerdo a la agresividad y riesgo metastático de un tumor
-mejorar la clasificación
-lograr una mejor estadificación
-dar información pronóstica
-monitorear la enfermedad en curso
-establecer o dirigir la terapia al predecir la sensibilidad o resistencia del tumor
-monitorearla o estudiar la biología de un tumor para aplicaciones posteriores.

Entre los marcadores tumorales, los marcadores de pronóstico son las moléculas capaces de dar información sobre el comportamiento del tumor y la evolución clínica que tendrá el paciente. El objetivo es asociar el marcador con el período de tiempo libre de enfermedad y el tiempo de supervivencia global. Los marcadores predictivos son moléculas útiles para seleccionar pacientes con alta probabilidad de responder exitosamente a un tratamiento determinado (ej.: marcadores hormonales para la terapia de ablación endócrina).
Entre los marcadores generales más utilizados en el diagnóstico y pronóstico de las neoplasias se incluyen:
-anticuerpos antiPCNA (Antígeno Nuclear de Proliferación Celular, se usa para medir la proliferación.
-anticuerpos contra la proteína Ki67 se cree que podría contribuir a la condensación de cromosomas y estar involucrada en la fragmentación de la envoltura nuclear durante la división celular.
-anticuerpos contra Factor VIII. El Factor Von Willebrand, identifica angiogénesis que seconsidera un proceso crítico en la progresión y diseminación de las neoplasias.
-anticuerpos anti CD31, también conocido como PECAM-1 (molécula de adhesión plaquetaria de la célula endotelial-1), un miembro de la superfamilia de las inmunoglobulinas, que media la adhesión celular.
-anticuerpos contra Factor de Crecimiento de Endotelios Vasculares (VEGF). VEGF ha sido identificado como uno de los factores más importantes de la angiogénesis tumoral y es el único mitógeno que actúa especialmente sobre las células endoteliales.
-anticuerpos anti ciclooxigenasa 2 (COX-2). COX-2 es una enzima inducible que interfiere con el desarrollo tumoral y la angiogénesis.
Además existen marcadores específicos en cada uno de los procesos tumorales, siendo actualmente muy amplia la lista de posibilidades de evaluación.

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