DIAGNOSTICO MOLECULAR EN ESPECIES NO TRADICIONALES: CHLAMYDIA Y CIRCOVIRUS PSITÁCIDO. – M.V. Javier A. Origlia

DIAGNOSTICO MOLECULAR EN ESPECIES NO TRADICIONALES:
CHLAMYDIA Y CIRCOVIRUS PSITÁCIDO.
M.V. Javier A. Origlia
Cátedra de Enfermedades de las Aves y los Pilíferos- Laboratorio de Diagnóstico de las Enfermedades
de las Aves y Pilíferos (LADEAP) Facultad de Ciencias Veterinarias Universidad Nacional de La Plata,
Calle 60 y 118 (1900) La Plata, Argentina.
javieroriglia@yahoo.com

XV CONGRESO NACIONAL DE AVEACA
Bs. As. 24 y 25 de Setiembre de 2015
Asociación de Veterinarios Especializados en Animales de Compañía de Argentina
P: 44

 

En las últimas décadas el desarrollo de distintas herramientas de biología molecular ha permitido ampliar las posibilidades para el diagnostico veterinario. La identificación de ADN y ARN a través de distintas técnicas ha llevado al desarrollo de numerosos ensayos relativamente rápidos y de alta sensibilidad y especificidad.
El diagnóstico molecular puede ser utilizado para:
-Diagnosticar agentesde enfermedades infecciosas.
-Detectar mutaciones hereditarias que subyacen a los trastornos genéticos  (pre o postnatales).
-Detectar mutaciones adquiridas que pueden conducir a la transformación neoplásica.
-Diagnosticar y clasificar genéticamente neoplasias.
-Determinar la relación y la identidad (paternidad, forense o coincidencia de donantes).
Estos métodos in vitro se basan en el hecho de que los códigos genéticos de los animales y sus patógenos son únicos. Este código genético se encuentra dentro de la molécula de ADN en dos hebras paralelas y complementarias de ADN que están unidas entre sí por enlaces de hidrógeno.
Estos enlaces cuando se calientan suavemente producen la separación de las dos hebras. Cuando hebras idénticas se ponen en proximidad, tienen lacapacidad de volver a la misma posición y formar nuevamente una molécula de ADN de doble hélice. Para poder utilizar este principio para fines específicos de diagnóstico se debe identificar partes o marcadores únicos para cada agente, entonces la presencia de dichos marcadores en una muestra tendría una fuerte correlación con la presencia de la enfermedad o el agente patógeno. Estos mismos principios se aplican a la detección de ARN, por lo tanto esta tecnología es de utilidad también en la detección de virus ARN.
Una de las aplicaciones de diagnóstico de la biología molecular es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La PCR permite amplificar más de un millón de veces un ADN obtenido a partir de una región seleccionada del genoma, siempre y cuando se conozca una parte de su secuencia de nucleótidos. Para la PCR se utilizan dos oligonucleótidos sintéticos de unos 15-20 nucleótidos que son complementarios a las zonas flanqueantes de la región que se quiere amplificar. Estos oligonucleótidos (habitualmente conocidos por su nombre en inglés, “primers”) actúan como cebadores para la síntesis in vitro de ADN la cual está habitualmente catalizada por una enzima llamada Taq
polimerasa.
La reacción se lleva a cabo en una serie de ciclos cada uno de los cuales incluye tres fases o pasos:

1. DESNATURALIZACIÓN: Para que comience la reacción es necesario que el ADN molde se encuentre en forma de cadena sencilla. Esto se consigue aplicando temperaturas de 90 a 95ºC que producen la rotura de los puentes de hidrógeno intercatenarios y por lo tanto la separación de ambas cadenas. Para conseguir la completa separación de las hebras de toda la muestra esta temperatura debe mantenerse unos minutos. Si el ADN solo se desnaturaliza
parcialmente éste tenderá a renaturalizarse rápidamente, evitando así una eficiente hibridación o unión de los primers y una posterior extensión.

2. HIBRIDACIÓN: Esta fase se denomina también fase de “annealing”. Una vez que el ADN está desnaturalizado se disminuye la temperatura hasta un rango comprendido entre los 40 y los 60ºC para que se pueda producir la unión de los primers a las secuencias flanqueantes del fragmento que se va a amplificar.

3. EXTENSIÓN: Durante este paso la Taq polimerasa incorpora nucleótidos en el extremo 3′ del primer utilizando como molde la cadena de ADN previamente desnaturalizada. La temperatura a la que se lleva a cabo este paso suele ser de 72ºC ya que es la temperatura a la que la Taq polimerasa alcanza su máxima actividad.
Los componentes básicos de una reacción de PCR son los siguientes: buffer de amplificación, cloruro de magnesio,primers, desoxinucleotidostrifosfatos (dNTPs), Taq polimerasa y ADN molde (muestra problema)
Cuando se aplica al diagnóstico, la prueba PCR (en sus distintas variantes) es en general la prueba más sensible. Todo el procedimiento para una PCR clásica puede ser realizado en un día de trabajo.
La reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) es la misma metodología aplicada a la amplificación de ARN.El desarrollo de otras variantes, como la técnica de PCR en tiempo real, implicó un refinamiento en la metodología y la automatización lo que permitió reducir notablemente el tiempo de amplificación y aumentar la precisión de la técnica. También la PCR en tiempo real permite cuantificar, mediante curvas de calibración, y los resultados pueden estar disponibles en unas pocas horas. Aunque una copia molde diana es teóricamente detectable, 10 copias de un molde diana en la muestra de diagnóstico se considera típicamente el límite de detección fiable para PCR en tiempo real.

Ventajas de estas técnicas:
-Alta sensibilidad y especificidad
-Rapidez
-Permite trabajar con patógenos difíciles de cultivar o identificar
-Permite detectar patógenos no viables para el cultivo o de materiales deficientemente conservados
-Alto grado de adaptabilidad (detección de nuevos patógenos).

Desventajas de estas técnicas:
-Alto costo
-Solo responde un interrogante por vez
-Nivel correcto de sensibilidad
-Control de calidad

Desde la introducción de los métodos moleculares las posibilidades de una rápida y específica detección de patógenos a mejorado considerablemente, y nos permite una diferenciación basada en ADN entre especies y una identificación directa desde muestras clínicas. A continuación desarrollamos una breve descripción de algunos de los patógenos detectados por métodos moleculares a partir de muestras clínicas en nuestro laboratorio.

CHLAMYDIA PSITTACI:
La clamidiosis es una enfermedad altamente contagiosa de las aves mascotas y de producción, que tiene implicancia zoonótica, causada por una bacteria intracelular obligada llamada Chlamydia psittaci. Todas las especies de aves son hospedadores potenciales del microorganismo pero la enfermedad clínica es más común de encontrar en psitácidos. Los casos se observan generalmente en animales sometidos a situaciones de estrés como por ejemplo; hacinamiento, mal nutrición, condiciones higiénicas inadecuadas, etc. El organismo produce una enfermedad sistémica y en ocasiones fatal. La morbilidad y mortalidad pueden variar según la especie hospedadora y el potencial patógeno del
genotipo involucrado. Las aves afectadas generalmente presentan anorexia, depresión, descarga nasal y ocular con dificultad respiratoria, diarrea y deposiciones amarillentas.
Diagnóstico de laboratorio:El diagnóstico de Chlamydia psittaci se basa en el aislamiento del agente en cultivos celulares o embriones de pollo, tinciones, la detección de antígeno o de anticuerpos. El diagnóstico definitivo está dado por el aislamiento e identificación del organismo en cultivos celulares o por la demostración de antígenos clamidiales o genes en muestras clínicas.

-Aislamiento: Se necesitan extremas medidas de bioseguridad en laboratorios especializados (BSL3), protocolos estandarizados y personal con experiencia. Los resultados pueden estar dentro de las 48 a 72 hs pero pueden extenderse a 2 a 6 semanas en algunas muestras.
-Tinciones histoquímicas: Diversas tinciones son utilizadas como Machiavello o Stamp o técnicas de inmunofluorescencia. Si bien esta metodología es relativamente simple, la especificidad es mucho más baja que el cultivo, y un resultado positivo solo nos indica la presencia de Chlamydia spp..
-Elisas (LPS, MOMP): técnicas de Elisa para la detección de antígeno clamidial LPS solo permite la detección de genero Chlamydia sin la identificación de la especie. En el caso de aquellos que se basan en la detección de MOMP tiene poca especificidad. Otra desventaja de estos métodos es que el límite de detección 102-105 unidades formadoras de inclusión puede ser insuficiente para ciertas muestras de campo.
-Detección de anticuerpos: diversos métodos son utilizados como MIF, fijación del complemento, Elisa anticuerpo. Estos métodos resultan laboriosos y con poca reproducibilidad entre laboratorios y son de baja especificidad. Otra limitante es que se necesita evidenciar un aumento de 4 veces el titulo entre sueros de un mismo paciente tomados en el inicio de la enfermedad y posteriormente a los 21 días de convalecencia.
-Métodos moleculares:las posibilidades de detección diagnostica de clamidias han mejorado desde la implementación de métodos moleculares, lo que permite la identificación directa desde muestras clínicas y la diferenciación de especies y genotipos. Las muestras sospechosas pueden ser testeadas por diversos protocolos de PCR, nested PCR o PCR en tiempo real. Estas técnicas en general se basan en la detección de fragmentos del gen 16srRNA, 23srRNA oompA. Los productos obtenidos por estas técnicas pueden ser posteriormente sometidos a secuenciación para determinar genotipos o realizar estudios filogenéticos. Otra técnica utilizada en la detección y genotipificación de clamidias es la basada en la tecnología Microarray.

Muestras:Para la detección por PCR se pueden utilizar muestras de materia fecal, hisopados cloacales, conjuntivales, orofaringeos y órganos obtenidos en la necropsia (pulmón, saco aéreo, bazo, hígado). Las muestras de materia fecal u órganos se deben colocar en recipientes estériles y pueden ser refrigeradas o congeladas hasta su envió al laboratorio. Cuando se utilizan hisopos es recomendable que estos sean de rayon o dacron (no utilizar madera y algodón)
Otras clamidias: El uso de estas metodologías diagnosticas ha permitido en los últimos años detectar la presencia de otras clamidias en las aves (C. abortus, C. pecorum, C.suis, C. trachomatis). Aunquese desconoce aun la implicancia en el desarrollo de enfermedad clínica de estas especies en las aves,se debe tener en cuenta que algunas de ellas como C. abortus son capaces de producir enfermedad en el humano. Por otro lado también se ha logrado determinar que la diversidad de clamidias es mayor a lo que se creía con el descubrimiento de dos nuevas especies: C. avium y C. gallinácea.
Chlamydia gallinácease encuentra principalmente en gallinas, pavos y otras aves de producción, y aun no está claro su rol como patógeno y su potencial zoonótico. Chlamydia avium se la encuentra principalmente en psitácidos y palomas, tanto en animales sin signos de enfermedad como también en cuadros respiratorios con la ausencia de otros agentes patógenos.

ENFERMEDAD DEL PICO Y LAS PLUMAS DE LOS PSITÁCIDOS (PBDF):
La PBDF afecta a una gran variedad de psitácidos alrededor del mundo, tanto en estado salvaje como en cautiverio.  esta enfermedad se caracteriza por un proceso crónico asociado a anormalidades de las plumas, deformación del ico y eventualmente la muerte. El agente etiológico es un circovirus, de la familia Circoviridae, de 14 a 17 nm, icosahédrico, no envuelto y con una sola hebra de ADN circular de aproximadamente 2000 nucleótidos de longitud, con dos ORFs mayores. El ORF V1 codifica para la proteína asociada a la replicación y el ORF C1 que codifica para la proteína de cápside. Se han aislado numerosas variantes, con mínimas diferencias en sus secuencias de ADN. Dichas variantes no parecen presentar distinciones respecto a patogenicidad y especificidad del huésped, con excepción
de una variante común, con manifestaciones clínicas no tan evidentes, que se observa en los loris (PsCV-2). El virus afecta principalmente a aves jóvenes y el periodo de incubación es extremadamente variable.Las aves infectadas excretan el virus en las descamaciones de la pluma y piel, heces y las secreciones del buche. Ingresando al ave susceptible por inhalación o ingestión. Puede transmitirse con facilidad a través de fómites. La transmisión vertical ha sido postulada; sin embargo, el papel de esta vía en la difusión de la enfermedad sigue siendo incierto. El virus es muy estable en el medio ambiente y puede permanecer infeccioso durante años.La replicación del virusse produceen varios tejidos, incluyendoel timo, bolsa de Fabricio, buche, esófago, intestino, piel yplumas. La displasia de la
pluma es el resultado de la necrosisy la disrupción del collar epidérmico, epidermis basal y la pulpade la pluma inducida por el virus,y la trombosisy hemorragiadentro de lapulpa de la pluma.Los daños en elepitelio germinaldel picoson similares. La necrosisde labolsa de Fabricio, timo y, posiblemente,los leucocitos circulantesda como resultadodiversos grados desupresión inmune. Debido a esto diversas enfermedadescausadas porpatógenos oportunistasson comunes en las aves infectadas con PBFD. La enfermedad clínica puede manifestarse dentro de 2 a 4 semanas posteriores al ingreso del virus en el ave. En general las aves menores a tres años son más susceptibles a la enfermedad. Pueden existir  períodos de incubación prolongados (meses e incluso años). En aves adultas inmunocompetentes habitualmente generan una respuesta y eliminan el virus. El virus puede ser detectado en la sangre antes de que se observen signos clínicos.Las especies mássusceptibles tanto en cautividad como en vida silvestre son los psitácidos del Viejo Mundo (Asia, Oceanía, África). Es un virus endémico en muchas poblaciones silvestres de psitácidos australianos. Es rara en las especies neotropicales.

Signos y lesiones:
Presentación hiperaguda: En aves recién nacidas. Es habitual no observar signos clínicos, si están presentes se ve animales deprimidos con signos de neumonía y diarrea Presentación aguda: Es la más común. En pollos durante el periodo de crecimiento de las plumas.
Están deprimidos, con diarrea y neumonía, resultado de la inmunodepresión. Plumaje afectado y con falta de polvo producido por la descamación de las plumas. El pico tiende a tener un color negro brillante, pudiendo tener malformaciones, como bandas de constricción, y cambios de color. En loros grises, las plumas de contorno aparecen rojas y se rompen con facilidad. Se considera que la condición es dolorosa para los pichones, por eso son reticentes a la manipulación. A veces los loros grises suelen presentar una forma de la enfermedad que se caracteriza por mínimas anormalidades en las plumas y una pancitopenia grave concurrente.

Presentación crónica: En aves adultas, la perdida y deformidades de las plumas son evidentes y la condición empeora en cada muda. La pérdida es simétrica y afecta a la cabeza. En el pico se puede ver hiperqueratosis de la capa superficial, que lleva a una elongación de este. Aparecen fisuras a lo largo, que pueden terminar en fracturas. Necrosis de la mucosa del paladar rostral. Un proceso patológico similar a la que ocurre en el pico también puede afectar las uñas Diagnóstico de laboratorio:diversos métodos se han utilizado para la determinación de la enfermedad, tales como la histopatología, inmunohistoquimica, hemoaglutinación, inhibición de la hemoaglutinación,
PCR. La prevalencia del virus dentro de poblaciones de psitácidos en cautiverio y silvestres varía entre el 10% y 94 % dependiendo del método de detección.La hematología puede presentar heteropenia grave con leucopenia y anemia generalizada. La microscopia electrónica de medula óseao de bolsa de Fabricio puede utilizarse como metodología diagnostica. A nivel histológico, puede observarse cuerpos de inclusión intracitoplasmaticos basofílicos e intranucleares en timo, bolsa de Fabricio y medula ósea de las aves infectadas.Las muestras utilizadas para diagnóstico molecular son de animales vivos sangre, plumas. Cuando procede de animales muertos pueden ser diverso órganos como hígado, bazo, bolsa de Fabricio. Las muestras de sangre pueden enviarse en tarjetas especiales de papel (tipo TFA) o sangre heparinizada. Las plumas de preferencia deben estar en crecimiento y ser colocadas en
un sobre de papel. Los órganos refrigerados o congelados en recipientes adecuados. Puede producirse falsos negativos si la muestra sanguínea contiene demasiada heparina, en los pájaros con leucopenia grave, se pueden presentar falsos negativos debido a una pequeña cantidad de virus circulante en la sangre.

ENFERMEDAD DE PACHECO:
Causada por un virus ADN denominado herpesvirus psitácido 1 (PsHV-1). El virus se excreta principalmente en las heces. La infección se produce a través de las vías oral y nasal, y se sospecha la transmisión vertical. Es común que existan aves portadoras, eliminando virus de manera intermitente sin presentar signos clínicos. Los guacamayos y amazonas suelen ser mássusceptibles. El virus infecta el tejido linfático, y en particular las células epiteliales y nerviosas. También se multiplica en hígado, bazo y riñón donde genera focos necróticos. Son comunes las muertes súbitas en las aves afectadas, si existen signos clínicos estos incluyen depresión, regurgitación y diarrea con uratos de
coloración verde, signos nerviosos. A la necropsia se observa hepatomegalia, nefromegalia y esplenomegalia, con focos de necrosis. Las aves en general están en buena condición corporal. La microscopia muestra cuerpos de inclusión intranucleares en hígado y bazo. El hemograma muestra leucocitosis que luego continua con leucopenia. La PCR se realiza a partir de órganos afectados (hígado, bazo), hisopos cloacales, materia fecal o hisopos respiratorios.

POLIOMAVIRUS:
Virus ADN. Se observa en periquitos australianos, inseparables, guacamayos, loro eclectus y cotorras.
También en amazonas, cacatúas, loris y loro cacique. La infección suele ser agua y fatal en cotorras jóvenes y se produce luego de la eclosión. En otras especies suele ser una infección crónica y subclínica. El virus se excreta en heces, piel, polvo de las plumas y es resistente en el medio ambiente. Existe la transmisión vertical. La eliminación viral se produce en periodos de aumento de estrés. Las presentaciones hiperagudas y agudas se observan en grupos de pollos de periquitos donde la mortalidad puede alcanzar el 100%. Son comunes las muertes súbitas, algunos pájaros presentan depresión, temblores, distención abdominal, ascitis y una coloración amarillenta de la piel
asociada a lesiónhepática, petequias en subcutáneo y folículos de la pluma. En algunos polluelos puede verse retraso del vaciamiento del buche. En ocasiones se observan signos neurológicos. En pájaros afectados después de las dos semanas de vida aparece la forma crónica o pichones que poseen anticuerpos maternales. Se observa perdida de las plumas remeras y timoneras (muda francesa).
Diagnóstico de laboratorio:Por medio de la histopatología encontramos cuerpos de inclusión intranucleares basofílicos y anfofílicos que desplazan la cromatina hacia el margen, en las células de los folículos de la pluma, riñones, hígado, bazo, esófago, piel, cerebro y corazón. La detección de anticuerpos puede realizarse por medio de una prueba de neutralización del virus teniendo en cuenta que resultados falsos positivos son posibles. La presencia del virus puede confirmarse mediante microscopia electrónica, tinción inmunofluorescente, aislamiento del virus o PCR a partir de un hisopado cloacal, material de las plumas, sangre, órganos

PARAMIXOVIRUS:
Virus ARN, existen 9 serotipos de paramixovirus aviares. El virus es eliminado por las secreciones corporales y es estable en el medio ambiente. El virus afecta las células epiteliales en los riñones, SNC, aparato respiratorio y digestivo. Pueden presentarse signos clínicos gastrointestinales (diarrea, disfagia), respiratorios (estornudos, secreción nasal, conjuntivitis) y nerviosos (tortícolis, parálisis). En palomas suelen presentarse formas atípicas en las cuales se observa diarrea persistente sin manifestaciones nerviosasDiagnostico por aislamiento viral o detección por PCR. En aves no vacunadas se puede realizar detección de anticuerpos por HI. Las muestras paradiagnóstico molecular pueden obtenerse a partir de materia fecal, hisopados cloacales, hisopados traqueales u orofaringeos
o a partir de órganos como pulmón, bazo o intestino. Al tratarse de virus ARN es necesario realizar la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR).

ADENOVIRUS:

Las infecciones por adenovirus han sido descriptas en numerosas especies de aves. La patogenicidad es generalmente baja y el rol que juegan en la enfermedad habitualmente es poco claro. Muchos adenovirus complican enfermedades inducidas en forma primaria por otros agentes o intervienen en procesos multifactoriales. Sin embargo algunos adenovirus son considerados como agentes primarios, por ejemplo el virus del síndrome de caída de postura, virus de la bronquitis de la codorniz, virus de la enteritis hemorrágica y el adenovirus de la paloma (PiAdV). Este último es responsable de dos formas clínicas de enfermedad: adenovirosis de tipo I (adenovirosis clásica) y adenovirosis de tipo II (hepatitis necrótica).
-Adenovirosis de tipo I: Ocurre principalmente en palomas menores a 1 año de edad, la infección se disemina rápidamente y en pocos días todas las palomas del palomar pueden enfermarse, por lo que la morbilidad puede llegar al 100 % pero la mortalidad generalmente es baja, salvo que se produzcan infecciones bacterianas secundarias (Eschericha coli). Se observa vómitos, diarrea acuosa aguda y pérdida de peso, la infección resuelve en aproximadamente 2 semanas, pero el bajo rendimiento deportivo se puede extender por varias semanas o meses. A la necropsia podemos observar una severa y aguda duodeno yeyunitis que puede ir de hemorrágica a fibrinosa (dependiendo de la presencia de infección bacteriana secundaria) y hepatitis. Microscopicamente se observa atrofia de las vellosidades y presencia de cuerpos de inclusión intranucleares en las células epiteliales de la vellosidad, el mismo tipo de cuerpo de inclusión puede observarse en los hepatocitos.
-Adenovirosis de tipo II: Afecta a palomas de toda edad. Son escasos los signos clínicos (vómito y diarrea acuosa amarilla) y las aves mueren dentro de las 24 a 48 hs. Durante un brote los casos van apareciendo durante un periodo de 6 a 8 semanas. La mortalidad puede variar entre el 30 al 70 % pudiendo llegar al 100%. A la necropsia se observa un hígado agrandado, decolorado o amarillento. En la histopatología encontramos una necrosis hepática extensa con cuerpos de inclusión intranucleares eosinófilos o amfofílicos.
En psitácidos afectados por adenovirus se observa depresión, anorexia y hemorragia cloacal. En casos más avanzados se encuentra conjuntivitis, encefalitis, pancreatitis, hepatitis y esplenitis, llevando al animal a la muerte. También se describen casos de muerte súbita. Las muestras para el diagnóstico son similares a las tomadas en la adenovirosis de las palomas.

Diagnóstico de laboratorio: histopatología, microscopia electrónica, asilamiento PCR. Las muestras de elección son hisopados cloacales, materia fecal, hígado e intestinos.

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